第135期 東曹色譜產品在質粒DNA純化與分析中的應用

2020年11月24日來源:管理員
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第135期? 東曹色譜產品在質粒DNA純化與分析中的應用

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質粒(plasmid)是一種小型環狀DNA,在基因工程中常利用質粒作為運載體,將目的基因轉移到受體細胞內。雖然近年來開發了不少更為先進的基因轉移載體(如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體等),但質粒載體由于制備簡便以及在各類細胞中的高效轉染率,仍然被大多數實驗室使用。

隨著基因治療的迅速發展,高純度的質粒DNA的需求量越來越大。在純化質粒DNA時,除了需要去除混入的蛋白質、RNA、內毒素和宿主基因組DNA等雜質以外,還需要去除質粒DNA的立體異構體Open circular體(開環狀質粒)和Linear體(直鏈線狀質粒),只對Supercoiled體(超螺旋狀質粒)進行純化。

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質粒的色譜分離模式

分離模式

分離方法

分離原理

去除雜質

純化步驟

尺寸排阻色譜

SEC

等度分離

分子尺寸的差異

(質粒分子較大,在排阻V0附近洗脫)

延遲洗脫

初期粗純

精制

陰離子交換色譜

AIEC

吸附/梯度洗脫

電荷的差異

(質粒帶高負電荷)

流穿或梯度

(質粒異構體分離)

捕獲

中間步驟

精制

疏水色譜

HIC

流穿

吸附/梯度洗脫

疏水性的差異

疏水性的差異

(質粒異構體分離)

捕獲

中間步驟

Ref.: Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified

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使用陰離子交換色譜分析質粒DNA

基因治療實驗中質粒純度的檢測方法之一是測量開環質粒和超螺旋質粒的相對量。下圖是采用陰離子交換色譜柱TSKgel DNA-NPR分析質粒的譜圖。此款色譜柱采用無孔的親水聚合物基質填料,表面由弱陰離子交換基團改性,具有極高的蛋白回收率。適用于對DNA片段,PCR產物及質粒的高效分離。

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質粒的純化工藝步驟示例

在質粒DNA的純化工藝中通常使用陰離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析。質粒DNA與內毒素相比,其疏水性非常低,所以使用疏水填料可以從質粒DNA中有效去除內毒素。

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Ref.: S.Palmieri et al., BioProcess International, 2011, Lonza webinar, modified

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使用Toyopearl Butyl-650S疏水填料純化質粒

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使用TSKgelTOYOPEARL分離純化質粒載體的應用實例

分離模式

色譜柱

應用

文獻名稱

SEC

IEC,HIC

TSKgel ? G-DNA-PW、

G6000PWXL、

DNA-NPR、Butyl-NPR

質粒DNA

Characterization ? of Plasmid DNA Samples ?by ? Chromatographic Methods

IEC

TSKgel ? DNA-NPR

質粒DNA

Separation ? of topological forms of plamid DNA by anion-exchange HPLC: Shifts in elution ? order of linear DNA

SEC

TSKgel ? G-DNA-PW、

G6000PWXL

質粒DNA

High-speed ? chromatographic purification of plasmid DNA with a customized biporous ? hydrophobic adsorbent

IEC

TSKgel ? DNA-NPR

質粒DNA

Effective ? and robust plasmid topology analysis and the subsequent characterization of ? the plasmid isoforms thereby observed

分離模式

層析填料

應用

文獻名稱

AFC

精氨酸固定化

AF-Epoxy-650M

超螺旋質粒DNA

Effect ? of Chromatographic Conditions on Supercoiled Plasmid DNA Stability and ? Bioactivity

HIC

Butyl-650M

質粒DNA

Improved ? downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy




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